Стаття Андрія Шевальова, написана під час роботи в Одеському рентген-радіо-онкологічному інституті (1946-1949 роки). Зберігається в архіві Володимира Мамчича у вигляді друкарських відбитків. При цьому невеликий фрагмент в кінці статті втрачено. Час і джерело публікації матеріалу невідомі.

Підготовка статті вимагала значної експериментальної роботи. Вказано проведення 278 лабораторних аналізів тільки на матеріалі жінок, хворих на рак шийки матки. Згодом здібності вченого-експериментатора дозволять Андрію Шевальову очолити лабораторію Інституту Філатова в Одесі і захистити блискучу докторську дисертацію з проблем етіології глаукоми.

Андрій Шевальов у середині 1940-х років

 

О СВЯЗИ ФЕРМЕНТА ИНВАЗИНА-ГИАЛУРОНИДАЗЫ СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМ РОСТОМ

Кандидат биологических наук А. Е. Шевалев

Из Одесского Рентгено-Радиологического и Онкологического института

(Директор – кандидат мед.наук А. П. Кияшов).

 

Согласно одному из распространенных в настоящее время взглядов в процессе роста рака шейки матки могут быть выделены две основные стадии:  преинвазивная и инвазивная стадии роста.

К первой стадии, согласно этому взгляду, необходимо отнести тот период в росте рака, когда рост раковых клеток еще ограничивается материнскими тканями, не выходит за пределы этих тканей, то есть еще не имеет места типичная для злокачественного роста инфильтрация раковыми клетками соседних тканей.

Эти процессы инфильтрации окружающих опухоль тканей раковыми клетками – инфильтрующий характер роста злокачествненных опухолей и являются характерной особенностью второй – инвазивной стадии роста.

Чем же обусловлен переход от одной стадии к другой, какими процессами в основном определяется специфический характер роста в инвазивной стадии?

К решению этих вопросов уже давно пытались подойти  с самых различных точек зрения, но пока вопрос этот по прежнему остается открытым.

К одной из таких оригинальных попыток объяснения инфильтрующего характера злокачественного роста тканей нужно отнести гипотезу, объясняющую этот характер роста ферментивными процессами. Сторонники этой гипотезы пытались объяснить инфильтративный характер роста специфической особенностью ферментов злокачественных опухолей к гетеролизу, то есть их способностью расщеплять белковые вещества других органов и тканей. Считали, что эта способность к гетеролизу либо специфична только для ферментов злокачественных опухолей, либо они обладают резко повышенным гетеролизом.

Пытались объяснить эту повышенную способность к гетеролизу либо наличием в злокачественных опухолях  каких-то специфических протеаз, либо в повышенном, в сравнении с другими тканями ферментов (наличие в опухолях активаторов протеолиза) и т.д.

Но все же, несмотря на всю привлекательность объяснения инфильтративного характера злокачественного роста ферментативными процессами,  эта гипотеза к настоящему времени не нашла достаточных подтверждений ни в одном из своих основных пунктов, на которые она опиралась.

Для подтверждения этой гипотезы по прежнему не достает убедительных доказательств в пользу того, что в процессе инфильтрующего злокачественного роста опухолевой тканью выделяется либо какой-нибудь специфический фермент, либо наблюдается выделение какого-нибудь фермента, имеющегося в других тканях, но в значительно больших, специфических только для злокачественного роста количествах. При этом необходимо, чтобы было доказано, что этот фермент может способствовать преодолению клеточных оболочек, основного вещества мезенхимы и тканевых барьеров, действуя на них неспецефически, то есть независимо от характера органа или ткани.

Работая по изучению ферментной системы фермент инвазин – гиалуронидаза и гиалуроновая кислота, мы поставили перед собой задачу попытаться выяснить, не может ли фермент инвазин- гиалуронидаза ответить этим требованиям, которые мы должны предъявить каждому ферменту, действие которого мы хотим хоть сколько-нибудь связать с процессом инфильтративного роста тканей.

Поводом к тому, что мы нашли возможным заняться этим вопросом, были следующие данные. Как известно, в настоящее время установлено, что основное вещество мезенхимы, межклеточное вещество, клеточные оболочки, межтканевые барьеры, связывающее вещество между эндотелиальными клетками капилляров и ряд других структурных элементов тканей и органов содержат в себе большое количество мукополисахарида- гиалуроновой кислоты. Эта кислота, обладая чрезвычайно высокой вязкостью,  определяет в значительной степени продвижение в тканях коллоидных растворов, взвесей и отдельных клеточных элементов (микроорганизмов).

Расщепление галуроновой кислоты в тканях специфическим ферментом группы протеаз муценаз. инвазином- гиалуронидазой приводит к резкому снижению вязкости содержащих гиалуроновую кислоту образований и значительно облегчает продвижение в этих тканях коллоидных растворов, взвесей и отдельных клеточных элементов (микроорганизмов).

Подобный механизм повышения проницаемости имеет место при распространении в тканях некоторых патогенных микроорганизмов, выделяющих фермент инвазин- гиалуронидазу, при проникновении сперматозоида, также выделяющего фермент инвазин- гиалуронидазу, в яйцевую клетку, при некоторых других процессах, а также этот механизм повышения проницаемости тканей под действием фермента инвазина может быть воспроизведен в эксперименте на животных.

Уже эти данные нам указывали на то, что фермент инвазин-гиалуронидаза, расщепляя гиалуроновую кислоту в тканях, может способствовать инфильтрующему росту клеток, облегчая их распространение в межклеточном веществе, основном веществе мезенхимы и преодолению на пути их роста межтканевых барьеров.

С другой стороны, целым рядом авторов (Бойланд и Мак Клин, Пири, Дюран-Рейнальдс и др.) установлено наличие в ряде злокачественных опухолей чрезвычайно большого, совершенно необычного для нормальных тканей количества фермента инвазин- гиалуронидазы. Посколько эти наблюдения были проведены не в процессе злокачественного роста, а на удаленных опухолях, проведены в основном на животных и, наконец, во многом противоречивы – все эти данные не могут послужить достаточным основанием для каких-либо заключений по вопросу о значении фермента инвазина в процессе злокачественного роста тканей в организме человека. Так, одними авторами был найден в ряде опухолей фермент инвазин-гиалуронидаза, другими в ряде опухолей обнаружено большое количество нерасщепленного субстрата того же фермента – гиалуроновой кислоты.

Для решения вопроса о значении фермента инвазина в процессе злокачественного роста тканей в организме человека нужно считать необходимым проведение следующих исследований:

• • Необходимо определить наличие фермента инвазина-гиалуронидазы в бреде, непосредственно окружающей опухолевые клетки в процессе их роста в организме человека.
  • Необходимо найти объяснение данным предыдущих исследователей, не обнаруживших в ряде случаев этого фермента в злокачественных опухолях.
  • Необходимо определить нарастание количества этого фермента в процессе усиления инфильтрирующего роста злокачественного новообразования.
  • Наконец, необходимо показать, что лечебные вмешательства, в той или другой степени приводящие к ослаблению инфильтрующего роста опухоли, уменьшают количество или активность выделяемого опухолевыми клетками ферманта инвазина-гиалуронидазы.

В настоящей работе мы приведем данные наших исследований фермента инвазина- гиалуронидазы в процессе роста злокачественных новообразований у человека, которые были нами предприняты с целью внести некоторые новые данные, способствующие выяснению указанных вопросов.

Определение фермента проводилось с помощью реакции Мак Клина в модификации Смирновой-Чистовича. Поскольку реакцией Мак Клина удается уловить только значительные количества фермента инвазина-гиалуронидазы, в наших исследованиях, естественно, найдут свое отражение лишь значительные количества этого фермента и ясно выраженные изменения в его активности. Определение же менее значительных количеств фермента требует разработки новых специальных и более точных методов.

В самом начале нашей работы перед нами прежде всего возник следующий вопрос: каким путем получать у больного несколько раз в процессе роста новообразования, при этом не производя никаких вредных для его здоровья вмешательств, необходимое количество жидкой среды, непосредственно окружающей опухолевые клетки. Решение этой задачи мы нашли для себя в собирании выделений с изъязвившейся поверхности опухоли. Как известно, раковые язвы характеризуются отсутствием какого-либо определенного, сформировавшегося раневого барьера. Через отдельные, остающиеся открытыми межтканевые щели на поверхность язвы попадает непосредственно содержимое межтканевых и межклеточных пространств. Все же в раковых язвах, находящихся на поверхности тела эти выделения быстро подсыхают с образованием струпа и собрать их в достаточном количестве не удается. Выход из этого затруднения мы нашли в получении выделений с поверхности язв при раках шейки матки. Специфические условия, в которых находятся эти язвы, препятствуют высыханию выделений на их поверхности. Все же количества собираемого таким путем выделения бывает обычно недостаточно для того, чтобы с ним в чистом виде поставить реакцию Мак Клина. Приходится выделение разводить в десять раз и только после этого ставить реакцию. Такое разведение, в свою очередь, снижает возможность определения в выделениях небольших количеств фермента и незначительных изменений его активности. Прежде, чем перейти к изложению полученных данных при раках шейки матки, мы на них не будем специально останавливаться.

1.   ФЕРМЕНТ ИНВАЗИН-ГИАЛУРОНИДАЗА В ВЫДЕЛЕНИЯХ ПРИ РАКЕ ШЕЙКИ МАТКИ

С целью выяснения  наличия фермента инвазин-гиалуронидаза в процессе роста рака шейки матки нами было произведено 278 реакций Мак Клина с выделениями у 91 больной. При этом в 99 реакциях у 42 больных был обнаружен фермент инвазин-гиалуронидаза. Таким образом, если учесть, что из общего числа 91 больных фермент был обнаружен у 42 больных, получается, что из всех случаев рака шейки матки реакцией Мак Клина удалось установить наличие фермента инвазин-гиалуронидазы у 46% больных, а у 54% определить его не удалось.

Для того, чтобы проверить, является ли наличие фермента инвазина-гиалуронидазы в наших случаях рака шейки матки в результате выделения его опухолью, а не в результате выделения этого фермента микроорганизмами, находящимися в церквикальном канале и в распадающейся части опухоли, нами были исследованы на наличие гиалуронидазы выделения шейки матки при различных воспалительных процессах в ней с эрозией и без эрозии шейки, при отсутствии злокачественной опухоли, а также при доброкачественных заболеваниях. С этой целью было произведено 39 реакций у 35 больных. Во всех указанных случаях даже при остро протекающих случаях воспалительных процессов, вопреки нашим ожиданиям, мы ни разу не обнаружили в выделениях с помощью реакции Мак Клина фермента инвазин-гиалуронидазу. Считать эти исследования за контрольную группу наблюдений мы считаем возможным, потому что, как известно, бактериологические исследования цервикального канала и поверхности распадающейся опухоли при раках шейки матки показали, что флора в этих случаях по своему составу обычно ничем не отличается от флоры при других неспецефических воспалительных процессах при раке шейки матки и в осоенности от флоры эрозии шейки матки с воспалительными явлениями. Таким образом, эти данные давали возможность сделать заключение о наличии при злокачественном росте опухолей у человека в его выделениях значительных количеств фермента инвазин- гиалуронидаза, полученного при помощи реакции Мак Кинли. С другой стороны, эти данные подтверждают наблюдения прежних авторов, показавших, что значительные количества фермента инвазин- гиалуронидаза удается констатировать не во всех опухолях.

Как же объяснить этот факт? С одной стороны можно было бы предположить, что фермент инвазин-гиалуронидаза не имеет непосредственного отношения к злокачественному инфильтрующему росту, а связан с какими-то другими процессами и поэтому его присутствие не всегда обязательно при процессе этого роста. С другой стороны, можно было бы предположить, что хотя фермент инвазин-гиалуронидаза и имеет непосредственное отношение к злокачественному росту опухолей и всегда имеется при нем, но, пользуясь методикой Мак Клина, мы можем определить его лишь в опухолях, содержавших его в очень больших количествах. Однако последнее предположение все же не может объяснить данных, полученных другими исследователями (Кабат, Меер и Наффи, Пири и другими, обнаружившими в злокачественных опухолях нерасщепленный субстрат этого фермента – гиалуроновую кислоту.

Анализ полученных нами данных, может быть, поможет внести некоторую ясность  в этот чрезвычайно сложный вопрос.

2.   ВОЗМОЖНЫЕ ПРИЧИНЫ НЕОБНАРУЖЕНИЯ ФЕРМЕНТА ИНВАЗИН-ГИАЛУРОНИДАЗА ПРИ РАКАХ ШЕЙКИ МАТКИ ПРИ ПОМОЩИ РЕАКЦИИ МАК КЛИНА В ВЫДЕЛЕНИЯХ БОЛЬНЫХ

Проводя ряд повторных исследований выделений у одной и той же больной в процессе роста злокачественного образования и, в частности, определяя реакцией Мак Клина титр, то есть показатель гиалуронидазо-активности выделений, нам удалось отметить следующий факт: Оказалось, что количество фермента инвазин-гиалуронидаза в выделениях, то есть титр гиалуронидазо-активности этих выделений у одной и той же больной в процессе злокачественного роста новообразования не остается неизменным.

Так, в большинстве случав можно было отметить, что необнаруженный на протяжении нескольких дней реакцией Мак Клина фермент инвазин-гиалуронидаза вдруг обнаруживался, причем обычно выделения, в котором его находили, вначале имели низкую гиалуронидазо-активность. Но постепенно или довольно быстро эта гиалуронидазо-активность выделений нарастала и достигала либо предельных (в определении реакцией Мак Клина) величин, либо просто значительных величин и, продержавшись некоторое время на этом уровне, опять более или менее быстро снижалась, доходя опять до неопределимых реакцией Мак Клина величин. Такие периодические колебания в содержании фермента инвазин-гиалуронидаза в выделениях у некоторых больных были один от другого значительными промежутками времени, у некоторых же, наоборот, часто сменяли друг друга.

Пытаясь объяснить наличие этих колебаний и, в частности, исчезновение фермента инвазин-гиалуронидаза из выделений накоплением в опухоли специфического антифермента антивазина мы пробовали в тех случаях, в которых реакцией Мак Клина фермент не был обнаружен, определять наличие в выделениях антивазина, но ни в одном из исследований нам найти его не удалось.

С другой стороны, в ряде случаев мы имели возможность отметить в стадии исчезновения фермента инвазин гиалуронидаза в выделениях, появление в них мукополисахаридов.

Таким образом, отмеченная нами периодичность в содержании фермента инвазин- гиалуронидаза при злокачественном росте новообразования в известной степени, как нам представляется, объясняет полученные нами и другими авторами данные в отношении обнаружения этого фермента в злокачественных опухолях.  Так, в зависимости от того, на какую фазу в динамике образования фермента приходилось наше исследование его, мы могли иногда обнаружить фермент, иногда же его не обнаруживали. Все же объяснить тот факт, что у некоторых больных, несмотря на то, что мы проводили у них в течение долгого промежутка времени ряд повторных исследований их выделений и не обнаружили ни в одном случае фермента, еще трудно. Конечно, и в этих случаях не исключена возможность того, что мы, производня наши исследования выделений, случайно не попадали на редкую и скоро преходящую фазу появления в выделениях фермента инвазин-гиалуронидаза или же у указанных количество выделяемого фермента вообще было ниже количеств, определяемых при помощи реакции Мак Кинли. Необходимо здесь же оговориться, что в целом ряде случаев многократное количество повторных исследований наличия в выделениях фермента инвазин-гиалуронидаза не могло быть произведено из-за невозможности получить в дни, назначенные для исследования, даже минимального количества выделений – 0,2 куб. сантиметра, необходимого для произведения реакции Мак Клина.

3.    НАРАСТАНИЕ КОЛИЧЕСТВА ФЕРМЕНТА ИНВАЗИН ГИАЛУРОНИДАЗА В ПРОЦЕССЕ ИНФИЛЬТРУЮЩЕГО РОСТА ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ

Из того, что было нами сказано о делении всего процесса роста рака шейки матки на преинвазивную и инвазивную стадии ясно, что для того, чтобы связать процесс инфильтрующего роста в инвазивной стадии хоть сколько нибудь с выделением растущей опухолью  фермента инвазин- гиалуронидаза необходимо показать отсутствие или ничтожное выделение этого фермента в преинвазивной стадии и, наоборот, появление его с началом инвазивной стадии и последующее увеличение его количества в опухоли одновременно с усилением инфильтрующего роста.

Выполнить эту задачу полностью, не располагая в настоящий момент методикой улавливания ничтожных количеств фермента инвазин- гиалуронидаза не представляется возможным. Но все же если  и обнаружение значительных отклонений в содержании этого фермента при помощи реакции Мак Клина покажет нам нарастание количества его в процессе злокачественного роста в зависимости от стадий развития новообразования, то выдвинутое предположение о возможной связи этих двух процессов уде получит известное подтверждение.

Для анализа полученных нами данным мы сочли необходимым сопоставить частоту обнаружения фермента инвазин-гиалуронидаза в выделениях различных больных со стадией заболевания. По стадии заболевания исследованные нами больные распределялись следующим образом:

І cтадия – 9 больных;

ІІ стадия – 33 больных;

ІІ-ІІІ стадия – 23 больных;

ІІІ стадия – 21 больная;

ІІІ-IV и IV стадии – 5 больных.

С самого начала уже можно было отметить тот факт, что, с одной стороны, во всех 9 случаях исследования больных в І стадии заболевания фермент инвазин-гиалуронидаза не был обнаружен ни одного раза, с другой стороны, у всех 5 больных в ІІІ-IV и IV стадиях указанный фермент был обнаружен. Что касается больных во ІІ, ІІ и ІІІ, ІІІ стадих, то соотношение между количеством больных, выделения которых содержали фермент инвазин-гиалуронидаза и количеством больных, в выделениях которых он не был обнаружен, было следующее:

ІІ стадия – из 33 больных у 22 (66%) фермент не был обнаружен, у 11 – обнаружен (34%).

ІІ-ІІІ стадия – из 23 больных у 8 (34%) фермент не был обнаружен, у 15 (66%) – обнаружен.

ІІІ стадия – из 21 больной у 7 (33%) не обнаружен, у 14 (67%) – обнаружен.

Из этих цифр мы видим, что в наших случаях мы наблюдаем известное увеличение частоты обнаружения значительных количеств фермента инвазин-гиалуронидаза, в течение развития злокачественного процесса.  Так, в ранних стадиях чаще отмечаются  значительные колебания в гиалуронидазо-активности выделений у одной и той же больной с резкими изменениями титра, то достигающего предельных величин, то быстро падающего. В более поздних стадиях, наоборот, более характерным является известное постоянство гиалуронидазо-активности выделений у отдельных больных, причем титр у них более медленный и не так резко изменяется, сохраняясь обычно в пределах средних величин.

4.    ИЗМЕНЕНИЕ ГИАЛУРОНИДАЗО-АКТИВНОСТИ ВЫДЕЛЕНИЙ ПРИ РЕНТГЕН-РАДИО-ТЕРАПИИ

Для выяснения вопроса об изменении гиалуронидазо-активности выделений при рентген-радио-терапии нами было проведено 140 исследований у 25 больных раком шейки матки, подвергшихся рентген-радио-терапии. Выделения исследовались на наличие фермента инвазин-гипалуронидаза до начала лечения, несколько раз в процессе лечения и по окончании курса лечения. Из указанных 25 больных у 11 больных были отмечены изменения в гиалуронидазо-активности выделений, у 14 же больных, как непосредственно перед лечением, так и во время и после лечения фермента инвазин-гиалуронидаза в выделениях при помощи реакции Мак Клина обнаружить не удалось, так что судить о каких бы то ни было изменениях гиалуронидазо-активности выделений этих больных представлялось невозможным. Необходимо отметить, что у трех из этих 14 больных фермент в выделениях перед рентген-радио-терапией нами обнаружен, но накануне лечения и в последующих исследованиях не появлялся.

Наиболее характерной картиной изменения гиалуронидазо-активности выделений при рентген-радио-терапии у тех 11 больных, у которых фермент был обнаружен, была следующая: непосредственно после первого облучения обычно отмечалось резкое повышение гиалуронидазо-активности выделений, достигающее высших величин и это повышение держалось относительно продолжительное время (3-4 дня) или же, напротив, быстро исчезало, достигая в большинстве случаев самых низких величин, либо вообще отмечалось полное исчезновение гиалуронидазо-активности выделений.

Интересно отметить, что такое резкое изменение в гиалуронидазо-активности выделений отмечалось наиболее рельефно после первого облучения, при последующих же облучениях эти изменения обычно были менее выражены.

Таким образом, даже на основании выявления значительных количеств фермента инвазин-гиалуронидаза при помощи реакции Мак Клина при злокачественном росте опухолей удается наметить известную связь между указанным ферментом  злокачественным ростом. Так как  при помощи реакции Мак Клина удается обнаружить наличие лишь значительных количеств фермента инвазин-гиалуронидаза, совершенно необычных для нормальных тканей в среде, непосредственно окружающей опухолевые клетки выявить более точно указанную связь было, к сожалению, невозможно.

Проведенные нами параллельно с определением фермента инвазин-гиалуронидаза исследования цитологической картины выделений показали отсутствие какой либо связи между количеством раковых клеток или обилием флоры в выделениях больных и их гиалуронидазо-активностью. В ряде случаев при большом количестве раковых атипических клеток или обильной флоры в выделениях больных выделения эти были не гиалуронидазо-активны  и, наоборот, выделения, в которых отмечались лишь единичные атипические клетки или очень бедная флора, показывали и высокую гиалуронидазо-активность.

Определенное объяснение этому факту необнаружения гиалуронидазо-активности выделений в ряде случаев можно найти в указанном нами выше периодическом колебании их гиалуронидазо-активности, а также в самом методе определения гиалуронидазы при помощи реакции Мак Клина, позволяющей определять лишь значительные количества фермента.

Сопоставление частоты обнаружения фермента инвазин…